在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加酶結合物和顯色劑后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育。

溫育的時(shí)間選擇

溫育這一步是ELISA測定中容易出現問(wèn)題的步驟。目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘-1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時(shí)才能有較*的結合，低于1小時(shí)，可能會(huì )影響測定下限。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。

溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。

溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過(guò)夜，以形成多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。

溫育的方式選擇

溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周?chē)着c中央孔結果的吸光度差異（“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深）?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應貼著(zhù)水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應板漂浮在水面上。

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若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個(gè)過(guò)程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。

無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時(shí)的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。

室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。為保證時(shí)間精確，一個(gè)人一次不宜多于兩塊板同時(shí)操作、測定。

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關(guān)于溫育，在實(shí)際測定操作中應注意

不同的溫育環(huán)境對檢測結果有影響，操作中應嚴格按照說(shuō)明書(shū)控制溫育時(shí)間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應。

為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時(shí)間嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一般加入待測標本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。

干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

試劑盒一般設定的反響溫度為 37℃，在這個(gè)溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會(huì )許多，對于全部反響體系來(lái)講，各種反響物的濃度會(huì )不斷添加，這么必會(huì )致使反響畢竟的值添加，溫育時(shí)貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁。

試劑盒斷定的一定溫度下的反響時(shí)間并不是反響的完畢，添加反響的溫度，會(huì )加速反響，一樣添加時(shí)間會(huì )延伸反響，這么得到的反響程度會(huì )比試劑盒斷定的反響程度多，也會(huì )引起陰性高值或假陽(yáng)性。

實(shí)驗操作的嚴謹性與實(shí)驗操作規范密不可分，未使用的試劑應儲存于2-8℃，使用時(shí)應回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的試劑混合使用，要經(jīng)常檢查酶標儀和微量移液器的精度和準備度……  ELISA看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是在實(shí)際操作過(guò)程中，絕不能掉以輕心，除了嚴謹規范的實(shí)驗操作，高品質(zhì)的試劑盒與專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團隊也是獲得準確結果的保證！