小鼠白細胞介素20(IL-20)ELISA檢測試劑盒一步法測定原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被小鼠白細胞介素20(IL-20)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過(guò)溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠白細胞介素20(IL-20)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長(cháng)下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度.

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種基于多孔板的免疫測定法,將通常作為檢測成分之一的抗體或樣品吸附在固體表面（此方法采多孔板）.ELISA以相對低廉的成本,快速 定量且靈敏地檢測分析物,是容易的分析方法之一.此外,ELISA還可輕松改造為更高通量篩選方法,幫助研究人員通過(guò)單次運行檢測大量樣品.夾心法 直接法和競爭法ELISAs

我們的ELISA采用簡(jiǎn)單易用的方法,可用于研究血清 血漿 細胞培養上清液或裂解液等各種基質(zhì)中的可溶性蛋白標志物.包括1000多種“僅供研究使用"的檢測試劑盒,適用的樣本類(lèi)型包括人 小鼠 大鼠等各種動(dòng)物模型（如農業(yè)和伴生動(dòng)物）.每份試劑盒都提供特定實(shí)驗方案及96孔板所需的試劑.ELISA試劑盒主要為96孔規格,目標物檢測和定量所需試劑都由廠(chǎng)商提供.采用夾心法 直接法和競爭法等各種ELISA方法.

夾心法使用針對同一目標抗原不同表位的一對單克隆抗體(mAb).固定在微孔板中的一抗,用于將蛋白從溶液中提取出來(lái).二抗則用于完成“夾心",提供表示目標抗原存在的信號.試劑盒提供重組形式的已知含量的抗原蛋白,方便用戶(hù)建立標準曲線(xiàn)解析樣品信號.我們大部分產(chǎn)品采用的都是這種夾心法ELISA.

直接法和競爭法比較少見(jiàn).直接法先用一種單抗檢測固定在微孔板上的樣品.然后一抗會(huì )與的酶標二抗結合提供信號.

競爭法在微孔板上預包被已知含量的生物標志物.酶標抗體與樣品共同孵育,并與預包被抗體進(jìn)行“競爭性"結合反應,具體結果取決于樣品中目標物的濃度.于是游離抗體能與微孔板上的抗原結合,并在樣品洗去后呈現信號.該信號與目標標志物的濃度成反比.

需自備的設備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個(gè)標準品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6. 樣品外觀(guān)：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內檢測），或-80℃（6個(gè)月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會(huì )影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。