預期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV) 屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，主要侵害偶蹄獸，有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia-I七個(gè)血清型?？谔阋甙l(fā)病以發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征，是國際獸疫局規定的A類(lèi)傳染病，易通過(guò)空氣傳播，傳染性強，流行迅速，偶爾感染人。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱(chēng)為畜牧業(yè)的“頭號殺手"。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測口蹄疫O型病毒（FMDV-O)，對FMDV-O引起的偶蹄獸類(lèi)病的診斷和監控具有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對口蹄疫病毒O型的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫病毒O型基因組模板的情況下，PCR反應得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過(guò)程中相應通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監測和輸出，實(shí)現檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為偶蹄獸類(lèi)基因組DNA，陽(yáng)性對照為失去活性的FMDV-O病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

新鮮采集的咽拭子、皰疹液和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2.應避免標本間交叉污染。

3.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(cháng)期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著(zhù)液體。

（2）核算當次實(shí)驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實(shí)驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽(yáng)性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

 (3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽(yáng)性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽(yáng)性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數進(jìn)行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時(shí)不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽(yáng)性對照：有典型S型擴增曲線(xiàn)或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數增長(cháng)期。

2.標本結果判定：

（1）陽(yáng)性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長(cháng)期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時(shí)應對標本進(jìn)行重復檢測，如重復實(shí)驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長(cháng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無(wú)Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的檢出可能會(huì )發(fā)生假陰性的結果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個(gè)檢測過(guò)程應嚴格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進(jìn)行操作，各區實(shí)驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實(shí)驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區應該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗后立即上機檢測；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。

3. 每次實(shí)驗應該設置陰、陽(yáng)性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內所配陰性和陽(yáng)性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。

6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進(jìn)行任何標記。

7. 儀器擴增相關(guān)參數應按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。