小鼠甲狀腺素（T4）定量檢測試劑盒（ELISA）操作方法

實(shí)驗原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗小鼠甲狀腺素（T4）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入小鼠甲狀腺素（T4）校準品和待測樣本，再加入HRP標記的小鼠甲狀腺素（T4）抗原（酶標抗原），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀450nm波長(cháng)上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度負相關(guān)。擬合校準品曲線(xiàn)，可以計算出樣本中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度。

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標示的有效期內使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用。

3、 跟其他廠(chǎng)家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì )干擾檢測結果，檢測前，請排出該因素。

7、 通過(guò)其他方法得到的檢測結果，與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、 加校準品與樣本時(shí)，每個(gè)校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、 合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗結果準確性的必要條件。

4、 使用自動(dòng)洗板機時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。

5、 底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會(huì )瞬間變?yōu)辄S色。

7、 實(shí)驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說(shuō)明書(shū)標明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過(guò)期試劑盒。

標準品濃度依次為：64、32、16、8、4、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶標儀（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸頭

3、 蒸餾水

4、 洗瓶或者自動(dòng)洗板機

5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6、 500ml量筒

生物安全

1、 檢測必須符合實(shí)驗室管理規范的規定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進(jìn)行處置。

2、 試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過(guò)敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。

4、 戴上防護手套，實(shí)驗完成后洗手。

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過(guò)程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、 細胞培養上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

2、 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復凍融。

3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。

樣本收集后，無(wú)法一次檢測完畢，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

4、 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。

5、 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過(guò)反復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。  

6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。

試劑準備

1、 使用前，所有的組分都要至少復溫60min，確保充分復溫到室溫。

2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì )有結晶產(chǎn)生，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內使用。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質(zhì)控品和樣品，建議做復孔。

1、 按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設置標準品孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。

3、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。

4、 用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、 揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復5次。若使用自動(dòng)洗板機，請按洗板機操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。

6、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結果計算

1、 以標準品濃度做為橫坐標，對應的吸光度（OD值）作為縱坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線(xiàn)擬合（4-pl），創(chuàng )建標準曲線(xiàn)方程，通過(guò)樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無(wú)破損漏氣。

2、劑量反應曲線(xiàn)線(xiàn)性

校準品劑量反應曲線(xiàn)相關(guān)系數r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。

4、靈敏度

小于0.1 ng/mL。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組小鼠甲狀腺素（T4），與結構類(lèi)似物無(wú)交叉。

7、穩定性

2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月。

8、 檢測范圍

2 ng/mL - 64 ng/mL