人唾液皮質(zhì)醇(SC)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

Human salivary cortisol(SC) ELISA Kit

產(chǎn)品貨號：RJ13602

產(chǎn)品規格：96T/48T

實(shí)驗原理：

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有人唾液皮質(zhì)醇(SC)抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、HRP標記的抗原，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人唾液皮質(zhì)醇(SC)呈負相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成：

試劑盒參數：

需自備的設備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個(gè)標準品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實(shí)驗前通過(guò)相關(guān)文獻預估樣本中待測物的濃度并通過(guò)預實(shí)驗確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過(guò)高或過(guò)低，請對樣本做適當的稀釋或濃縮。

2. 若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議做預實(shí)驗驗證其檢測有效性。

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

4. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

6. 細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

7. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

8. 樣品外觀(guān)：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

9. 樣品保存：樣品收集后若在1周內進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內檢測），或-80℃（6個(gè)月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會(huì )影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。

檢測前準備工作：

1. 請提早10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 標準品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為20ng/mL)，然后按照以下濃度：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0ng/mL進(jìn)行稀釋。

倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數第二管中吸取液體，具體如下圖。

3. HRP-抗原工作液配制：使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用。

4. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象，可放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置)。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照50μl每孔加入相應孔中，空白孔加入50μL通用稀釋液，緊接著(zhù)每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試，從而減少基質(zhì)效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時(shí)需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。

3. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。

4. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。

5. 加終止液：每孔加入終止液50μL，立即在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。

結果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(xiàn)(作圖時(shí)去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值低于標準曲線(xiàn)上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時(shí)乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線(xiàn)：

以下數據和曲線(xiàn)僅供參考，實(shí)驗者需根據自己的實(shí)驗建立標準曲線(xiàn)。

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線(xiàn)計算標本含量。

試劑盒性能：

1. 重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。

2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人SC，計算回收率

3. 線(xiàn)性稀釋?zhuān)悍謩e在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入高濃度人SC，在標準曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)范圍內進(jìn)行稀釋?zhuān)u估線(xiàn)性。

注意事項：

1. 嚴格按照規定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會(huì )破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。