昆蟲(chóng)ELISA試劑盒方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測過(guò)程中除正常反應外，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯誤的結果。引起昆蟲(chóng)ELISA試劑盒測定錯誤結果的原因主要有：①標本因素;②試劑因素;③操作因素。下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。
1.樣品稀釋
酶聯(lián)免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋?zhuān)豢杀苊鈺?huì )產(chǎn)生很強的非特異性反應，出現假陽(yáng)性。
2.試劑盒平衡
試劑盒中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20——30分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì )造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.昆蟲(chóng)ELISA試劑盒樣品和試劑的混勻
稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。
4.加樣
在現在的ELISA試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性
5.溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。
6.洗板
固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測定的特異性。
7.昆蟲(chóng)ELISA試劑盒邊緣效應
使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實(shí)驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。
8.顯色
顯色一定要控制時(shí)間，根據試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結果偏低;顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)，空白增高或者非特異性顯色增加。
9.比色
比色要注意波長(cháng)的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(cháng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時(shí)更換。因此，容易出現濾光片錯用的問(wèn)題。
其次，單波長(cháng)或雙波長(cháng)比色選擇的問(wèn)題。所謂的單波長(cháng)比色即是通常的以對顯色具有吸收的波長(cháng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測定;而雙波長(cháng)雙色則酶標儀在敏感波長(cháng)如450nm和非敏感波長(cháng)如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和;非敏感波長(cháng)下測定即改變波長(cháng)至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測得的吸光度即為臟物的吸光度值。